Miš koji „pali lampice kad mu prorade geni: fluorescentna transkripcija uživo

Biolozi, fiziolozi i genetičari su desetljećima promatrali i analizirali biološke procese na način koji bi i najrevniji policijski istražitelji smatrali pomalo agresivnim: stanice su prvo izvadili iz tijela,zaustavili u vremenu (formalinom, zamrzavanjem, ulijevanjem u parafin…) zatim ih mikroskopski tanko izrezali i rastavili, obojali umjetnim bojama i tek potom analizirali što se – navodno – dogodilo. Temeljni nedostatak te metode nije to što je neprecizna ili netočna (premda dijelom jest), nego što je posve statična: ona prikazuje trenutak u vremenu – fotografiju, a ne film, a kamoli „live stream“ prijenos trenutnih procesa u tkivima.

Nova studija istraživača s Instituta za znanost iz Tokija oživotvorila je davnu želju molekularne biologije da se transkripcija gena može vidjeti u trenutku dok se zaista događa, u stvarnim tkivima, u živom organizmu. Ne zato što bi to služilo kao atraktivan prikaz na prezentacijskim slajdovima, nego zato što je transkripcija gena stvarni temelj svega što svaki živi organizam radi – od rasta i razvoja, preko metabolizma i proizvodnje proteina, do imunološke obrane, održanja zdravlja ili ponašanja u bolesti.

Fotografija umjesto filma

Školska objašnjenja genetike zvuče logično i uredno: geni iz DNK se prepisuju u RNK (transkripcija), RNK se u ribosomima prevodi u proteine (translacija), proteini rade svoje poslove za koje su namijenjeni, pa život nesmetano teče dalje. U laboratoriju to međutim izgleda daleko manje uredno i pregledno: transkripcija nije tipka „ON/OFF”, nego složena, prostorno organizirana i vremenski promjenjiva aktivnost koja se istovremeno odvija natisućama genskih zapisa (lokusa).

Dodatni problem je što se ključni detalji transkripcije događaju u staničnim jezgrama, dakle na vizualnoj skali koja je ispod rezolucije većine klasičnih tehnika prikaza, a sve to u živom tkivu koje ima tri dimenzije, krvne žile, vezivnu stromu, imunosne stanice, mehanička naprezanja… cijeli zoološki vrt događaja, uvjeta i uzajamnih interakcija.

Zato su do sada sve standardne metode proučavanja genske transkripcije prikazivale dvije odvojene stvari: ili su mjerile prosječnu količinu (npr. koliko se neke RNK nalazi u tkivnom uzorku izvađenom iz tijela) ili su davale statičnu prostornu sliku (fotografiju) – ali tek nakon histološkog fiksiranja (“ubijanja”) uzorka tkiva. Jedna je metoda govorila koliko, a druga prikazivala gdje; no vrlo rijetko je bilo koja od tih metoda mogla reći kada i kakose događaju procesi transkripcije.

Ono što tokijski laboratorijski miš donosi nije zamjena za dosadašnju transkriptomiku (metode za promatranje RNK transkripcije u stanicama), nego posve nova dimenzija: vizualni uvid u proces prepisivanja gena u proteine – u stvarnom tkivu i u stvarnom vremenu.

RNK polimeraza II sa semaforom na „repu”

Većinu glasničke RNK (mRNK) u stanicama sintetizira enzim koji se zove RNK polimeraza II (Pol-II). To nije samo enzim koji „klizi po zavojnici DNK” i prepisuje redoslijed baza u genima; Pol-II je platforma na koju se kače i s nje otpadaju deseci različitih faktora transkripcije, a njezin C-terminalni dio, CTD („rep“ sastavljen od ponavljajućih peptidnih fragmenata), ponaša se kao signalna traka. Na toj se traci događa fosforilacija – proces koji označava u kojoj se fazinalazi transkripcija.

Jedan od najpouzdanijih markera produktivne elongacije (faze transkripcije u kojoj polimeraza ne stoji nego stvarno „ispisuje” RNK) je fosforilacija serina na poziciji 2 (što genetičari označavaju kraticom Ser2ph). Kad je Ser2ph prisutan, Pol-II je u ozbiljnom radnom režimu, a transkripcija gena u punom pogonu.

Ideja je bila jednostavna: ako bi se Ser2ph mogla detektirati i vidjeti uživo, dobio bi se signal koji javlja i pokazuje gdje je transkripcija u tijeku, gdje u jezgri trenutno radi taj cijeli „prepisivački“ pogon.

Mintbody: antitijelo koje se ne boji citoplazme

Klasično rješenje koje se koristi za detekciju bilo kojeg proteinskog markera (pa tako i Ser2ph) je specifično antitijelo. Naravno, uz klasična rješenja idu i klasični problemi: antitijelo obično dolazi u stanicu izvana i traži da mu se „otvore vrata“: biolozi koriste izraz „stanicu treba permeabilizirati“, što u praksi znači da živost (i život) unutar stanice prestaje i gasi se u zamrznutu sliku.

Koncept „mintbody” (modification-specific intracellular antibody) ide drugim putem: umjesto da se antitijelo unosi u stanicu, stanicu se genetski navede da sama proizvodi unutarstanični vezni protein, specifični marker koji prepoznaje točno određeni cilj – u ovom slučaju taj cilj je „rep“ RNK polimeraze II, odnosno Ser2-fosforilirani CTD. Na taj se markerski protein potom spoji svjetleći, fluorescentni dio (tzv. „reporter“), pa se u jezgri pojave svjetleće točkice i žarišta na mjestima gdje je cilj (Ser2ph) prisutan.

Ono što su autori sada napravili jest knock-in miš koji taj fluorescentni mintbody izražava u tkivima organizma. Ne u jednoj kulturi stanica, ne u jednom organoidu, nego u živom sisavcu koji diše, raste, stari i razvija se.Pod mikroskopom to izgleda kao skupina žarišta u jezgri – „transkripcijski fokusi” – koja predstavljaju mjesta gdje je elongacija aktivna. Drugim riječima, mjesta gdje su geni aktivirani i njihov „zapis” iz DNK u tom trenutku prelazi u mRNK.

Što se vidi u tkivima

U gotovo svim tkivima koje su autori analizirali, jezgre stanica pokazuju brojna fluorescentna žarišta. To je bilo i očekivano – jer život je, na molekularnoj razini, stalno prepisivanje gena i stvaranje proteina. No, broj i intenzitet tih fokusa nisu uniformni: u nekim staničnim populacijama signal je jači, u drugima slabiji.

U objavama koje tumače sadržaj istraživanja ističe se zanimljiv kontrast među imunosnim stanicama: T-limfociti pokazuju jaču transkripcijsku aktivnost od neutrofilnih leukocita. Takav nalaz potvrđuje ranije poznate činjenice, no sada u realnom vremenu: T-stanice su adaptivne, regulacijski bogate, s programima koji se mijenjaju ovisno o aktivaciji, dok su neutrofili kratkoživući „ratnici“ s drugačijom „borbenom namjenom”.

U testisima (mišjim, naravno) se mogu pratiti faze spermatogeneze tijekom kojih transkripcija mijenja svoju aktivnost. Fokusi fluorescencije na razini jezgre omogućuju uredno mapiranje „gdje se ne radi” jednako jasno kao i „gdje se radi”.

Sve ovo vjerojatno zvuči kao strogo stručni detalji namijenjeni tek uskoj znanstveničkoj i genetičarskoj publici, ali u praksi znači da mintbody koncept ne daje samo šarenu vizualizaciju i atraktivnu svjetlucavu estetiku, nego prati stvarnu organizaciju i funkciju aktivnosti gena unutar stanične jezgre, što otvara cijeli spektar vrlo uporabljivih namjena u budućim istraživanjima i praktičnoj primjeni ove biotehnologije.

Već otprije postoji velik broj istraživanja u kojima se GFP (zeleni fluorescentni protein) i fluorescencija koriste kao biomarkeri, a o nekima smo pisali i na ovom portalu. Najveća inovacija koju donosi mintbody je u tome što su markeri do sada najčešće bili usmjereni samo na jedan protein, jednu staničnu populaciju ili jedan proces koji se želi pratiti, a ovdje je marker usmjeren na nešto što je blizu univerzalnog „metaboličkog pulsa” stanice: na aktivnu transkripciju mRNK.

Drugim riječima, ovdje nije riječ o konceptu „obojali smo neuron… pa sada vidimo neuron”; ovo je pokušaj da se vizualizira sama činjenica da stanica u datom trenutku prepisuje gene. To je viša razina nadzora – ne nad jednim radnikom, nego nad cijelim pogonom.

Što se s time može raditi?

Potencijal ovakvog modela je u tome što daje na uvid live-kartu genskog prometa stanice: gdje u jezgri teče elongacija i kako se to mijenja kroz vrijeme. Time se iz posve novog, daleko informativnije kuta gledanja može analizirati brojne do sada slabo poznate procese. Primjerice – razvoj i diferencijacija tkiva, proces u kojemstanice iz neutralnih, matičnih stanja u prelaze specijalizirane identitete. U tom prijelazu transkripcija se reorganizira – ne samo količinski, nego i prostorno. Model omogućuje da se promjene u transkripcijskim žarištima prate kroz diferencijaciju, potencijalno i u živim uzorcima tkiva.

Moguće je promatrati i ponašanje tumorskih stanica i tkiva u mikrookolišu.Rak nije samo mutacija i nekontrolirana dioba, nego i reorganizacija transkripcijskih programa. Osim toga, tumor se u živom organizmu nalazi u interaktivnom mikrookolišu u kojem se tumorske stanice ponašaju drugačije nego u laboratorijskoj kulturi karcinomskog tkiva. Vizualni readout elongacije mogao bi pomoći u mapiranju aktivnosti tumora: gdje su „vruće zone” transkripcije, a gdje su stanice u tišem režimu. A to bi mogao biti prvi korak prema traženju preciznijih terapijskih oružja za napad na rak u fazama u kojima je najosjetljiviji.

Starenje i degeneracija tkiva koja ga prati mijenjaju epigenetski krajolik i regulaciju gena. Ako se u starijim tkivima promijeni broj, raspored ili dinamika elongacijskih fokusa, dobiva se nova vrsta funkcionalnog biomarkera nuklearne reorganizacije i uvid u lokaciju i tajming genskih procesa koji sudjeluju u procesima starenja i propadanja.

Još jedno područje potencijalne korisnosti detekcije i fluorescentnog markiranja Ser2ph su farmakologija i toksikologija. Mnogi lijekovi – ciljano ili za nuspojavu – mijenjaju transkripciju u stanicama: neki inhibiraju kinaze koje fosforiliraju CTD, neki utječu na epigenetske mehanizme, neki izazivaju stresne odgovore koji preslaguju ekspresiju gena. Ovakav „svjetleći miš“ može postati vizualni test: događa li se nakon lijeka opći pad elongacije, prelazak u drugačiji prostorni raspored ili promjena u dinamici fokusa.U idealnom scenariju, mogao bi biti izravni pokazatelj djelovanja lijekova u živom tkivu.

Ograničenja

Ovakvi modeli su fascinantni, ali najbolji su kad se prema njima odnosi kao prema preciznom instrumentu, ne kao prema univerzalnom i čudesnom alatu. Prvo, marker je sam po sebi vrlo specifičan: veže se na Ser2ph koji je odličan pokazatelj elongacije, ali ne govori sve o započinjanju, pauziranju ili završetku procesa transkripcije, pa ni o transkripciji koja ide drugim enzimskim sustavima osim polimeraze II. Naime, Pol-I i Pol-III zajedno nose preko 80% ukupne sinteze RNK u stanicama, tako da na Pol-II otpada manje od 20%. Međutim, premda Pol II sintetizira samo 20% ukupne mase RNK, ona sintetizira gotovo 100% kodirajuće RNK (mRNK), što još više ističe važnost modela za praćenje ekspresije proteina.

Drugo, postoji opće pravilo koje vrijedi kod korištenja fluorescentnih markera: čim nešto vežeš na protein, postoji mogućnost da si ga promijenio. Autori ovog istraživanja svoj pristup predstavljaju kao vjerodostojan i točan („robustan“), ali pitanje „koliko marker smeta?” uvijek ostaje u pozadini i ponekad se mora rješavati dodatnim eksperimentima i usporedbama.

Treće, interpretacija žarišta može biti složena. „Fokusi” se često opisuju kao transkripcijska mjesta (klasteri), ali biologija jezgre nije organizirana kao uredan ured s jasno označenim „radnim mjestima“. Ono što se vidi može biti kombinacija više fenomena i procesa.

Sve to ipak ne umanjuje vrijednost koncepta, već podsjeća da će se najviše koristi dobiti kad se ovaj model kombinira s drugim markerima i metodama.

Svjetlo koje pokazuje gdje se „ispisuje život”

Novinski naslovi vole izraz „svjetleći miš”, ali prava vrijednost je prozaičnija i važnija: dobiven je alat koji omogućuje da se u tkivima živog sisavca vidi gdje RNK polimeraza II elongira, odnosno gdje se DNK u tom trenutku prepisuje u RNK. To je korak od fotografije prema filmu, od prosjeka prema prostoru, i od laboratorijske staklenke prema živom organizmu.

Ako se model pokaže dovoljno stabilnim i dovoljno „neškodljivim” za procese koje prati, mogao bi postati jedan od onih alata koji ne mijenjaju samo rezultate, nego mijenjaju i način na koji postavljamo pitanja. A u znanosti je postavljanje novih pitanja obično trenutak kad se počinju događati prave promjene.

_{Reference i poveznice}

^{Igor „Doc“ Bereckije pedijatar-intenzivist na Odjelu intenzivnog liječenja djece Klinike za pedijatriju KBC Osijek. Pobornik teorijske i praktične primjene medicine i znanosti temeljene na dokazima, opušta se upitno ne-stresnim aktivnostima: od pisanja znanstveno-popularnih tekstovau tiskanom i online-izdanju časopisâ BUG, crtkanja računalnih i old-schoolgrafika i dizajna, zbrinjavanja pasa i mačaka, fejsbučkog blogiranja o životnim neistinama i medicinskim istinama, sve do kuhanja upitno probavljivih craft-piva i sasvim probavljivih jela, te neprobavljivog sviranja bluesa.}