Prisluškivanje sinapsi: kako iGluSnFR4 dešifrira „ulaznu poštu mozga

Neuroznanost je desetljećima nalikovala promatranju milijunske metropole noću iz aviona: vidjelo se gdje svijetle prozori, zgrade, ulice i kvartovi, gdje se pale i gase „žarulje“ aktivnosti, ali iz te nepregledne i konfuzne slike bilo je nemoguće iščitati koje se poruke i kakva komunikacija odvija među ljudima koji žive iza tih osvijetljenih točaka. Zašto je baš onaj prozor u potkrovlju zasvijetlio, pa se uskoro ugasio?

Mozak kao crna kutija

Električnu aktivnost neurona, njegov output – u neurofiziologiji poznat pod nazivom akcijski potencijal – već je duže vrijeme moguće mjeriti relativno lako, gotovo rutinski: koriste se elektrode, optički senzori napona ili indikatori koji detektiraju nagli porast kalcijevih iona unutar stanice. Sve to uglavnom hvata ono što neuron odašilje „prema van“, kada nešto poručuje ostatku mreže.

Međutim, ono što neuron prima – suptilni kemijski šapat njegovih neuronskih susjeda s kojima izravno kontaktira (znate već: taj „dodir“ dvaju neurona zove se sinapsa) i u sinaptičkoj pukotini razmjenjuje neurokemijske informacije – dugo je ostajalo izvan dosega. Ne zbog manjka interesa, nego zbog fizike same poruke: priroda je sinaptičku komunikaciju svela na ekstremni minimalizam, na par stotina neurotransmiterskih molekula prisutnih u mikroskopskom prostoru sinaptičke pukotine tek djelić milisekunde prije nego što se rasprše, razgrade i nestanu. Rezultat je bio asimetričan uvid u rad mozga: izvrsno poznavanje oskudnih neuronskih monologa, uz vrlo mutnu sliku o bogatom mrežnom dijalogu.

No odnedavno, pojavom četvrte generacije glutamatnog senzora nazvanog iGluSnFR4, paradigma se pomiče u korist boljeg i detaljnijeg prepoznavanja i analize protoka neurotransmiterskih poruka na sinapsama: postaje moguće u realnom vremenu pratiti neuralnu „ulaznu poštu“, kao da se čita inbox neurona, i to izravno u živom tkivu. Što znači da se može uživo pratiti tijek razgovora među neuronima, a ne samo njegove posljedice.

Zašto je glutamat ključan?

Ako bi se birala jedna neurotransmiterska molekula kao „glavna valuta“ aktivacije neurona u mozgu sisavaca, tu bi titulu ponio glutamat. Velika većina ekscitacijskih sinapsi u središnjem živčanom sustavu oslanja se upravo na njega. Glutamat je molekularno pogonsko gorivo na kojem počivaju učenje, memorija i sinaptička plastičnost.

No, izravna detekcija glutamata uživo, „u akciji“, predstavlja bioinženjersku noćnu moru. Jedan akcijski potencijal obično rezultira otpuštanjem tek jedne sinaptičke vezikule (mikroskopski sitnog mjehurića ispunjenog molekulama neurotransmitera) u sinaptičku pukotinu. Tamo se tada načas pojavljuje ekstremno mala količina glutamata, koja se odmah gotovo trenutačno uklanja, raspršuje (difundira) ili se veže na receptore – i nestane brže nego što uobičajeni senzori uopće stignu reagirati i registrirati.

Dosadašnja rješenja, premda nerijetko maštovita, patila su od kroničnih bolesti: od visokog pozadinskog šuma koji zamagljuje transmisijski signal, od tromosti zbog koje se propušta registrirati brze promjene, a ponajviše od nemogućnosti skaliranja na razinu cijele mreže. Jer jedno je analizirati kemijski signal na pojedinačnoj sinapsi, a posve drugo pratiti stotine ili tisuće sinapsi istovremeno i pritom jasno razdvojiti pojedinačna otpuštanja neurotransmitera na njima. Stoga je analiza sinaptičke kemijske komunikacije do sada više pripadala domeni teorije i simulacija nego „živom“ analitičkom laboratoriju.

iGluSnFR4: intenzitet i svjetlina glutamata

Naziv iGluSnFR (izgovara se kao „I, glue sniffer“) možda zvuči opušteno i neozbiljno (jer snifanje ljepila je inače pouzdan način za uništavanje moždanih stanica), ali iza njega stoji vrlo ozbiljan pothvat molekularnog inženjeringa. Riječ je o genetski kodiranom proteinskom senzoru glutamata: protein je dizajniran tako da promijeni fluorescenciju u trenutku kada se veže na molekulu glutamata. Drugim riječima, radi se o „pametnoj“ molekularnoj zamci koja zasvijetli svaki put kada je kroz sinapsu prošlo ono o čemu treba alarmirati promatrača.

Put do četvrte generacije, opisane u časopisu Nature Methods, bio je proces strpljive, minuciozne selekcije i iteracije. Istraživački tim je kroz masivni screening testirao tisuće varijanti proteina – kao da se u velikom računalnom programu mijenja jedan po jedan redak koda, pa se svaka verzija vraća na test: je li brža, je li svjetlija, je li stabilnija.

Fokus je bio na dva parametra: na intenzitetu svjetline (s ciljem da fluorescentni signal bude vidljiv kroz tkivo) i na kinetici (u želji da se senzor nakon registriranja signala što brže „resetira“ i bude spreman registrirati novi signal).

Naposljetku su odabrane dvije molekularne varijante s namjerno različitim ponašanjem: iGluSnFR4f (fast), koji ima brže vrijeme deaktivacije (oko 26 milisekundi), pogodno za brze skokove i visoke frekvencije, i iGluSnFR4s (slow), koji dulje ostaje u „svjetlećem“ stanju (oko 153 ms), što olakšava snimanje velikih populacija sinapsi uz manje ekstremne zahtjeve za osjetljivim kamerama.

Ključna prednost ovakvog pristupa je osjetljivost na razini jedne sinaptičke vezikule (single-vesicle sensitivity) i to u živom mozgu. U svijetu mikroskopije, to je otprilike ekvivalent detektiranju pada igle u punoj areni dok traje utakmica – i pritom još razlikovati je li igla pala jednom ili je odskočila i pala dvaput.

Od fragmenata do rečenica: kako neuroni „računaju“

Neuroni nisu tek žice koje prenose impulse od točke A do točke B. Oni su procesori koji stalno integriraju ulaze i izlaze.

Za razliku od binarne logike računalnih nula i jedinica, neuronalni signal vođen je fuzzy logikom: tipičan neuron prima tisuće sinaptičkih inputa na sinapsama koje se nalaze na kratkim ograncima (dendritima), a odgovor na pitanje izlaza – „kada će se odaslati signal prema van“ – nije rezultat jednostavnog zbrajanja, nego kombinacija tajminga, lokacije signala na dendritskom stablu, prethodnog iskustva (plastičnosti) i lokalne biokemije.

To je ono što neuroznanstvenici nazivaju „neuronal computation“. Do sada se mjerio izlaz (ispaljivanje), ali se teško moglo vidjeti koja je točno kombinacija ulaza dovela do te „odluke“. iGluSnFR4 omogućuje pogled na izvorne podatke prije nego što ih neuron obradi.

Metafora iz popularnih prikaza ovdje dobro pogađa bit: do sada je postojala knjiga u kojoj su riječi razbacane po podu bez reda. Sada te riječi dobivaju sintaksu i gramatiku. Može se vidjeti koji susjedni neuroni „glasaju“ za aktivaciju, koji šute, i kako se ti uzorci mijenjaju tijekom učenja ili izlaganja novim podražajima.

Tehnički kutak: Od meduza do molekularnih senzora

Da bi se razumjelo kako iGluSnFR4 uopće funkcionira, potrebno je zaviriti u svijet fluorescentnih proteina. Temelj ove tehnologije je GFP (Green Fluorescent Protein), bjelančevina koja prirodno nastaje u određenim vrstama meduza i koja ima jedinstvenu sposobnost da zasvijetli pod ultraljubičastim svjetlom.

Tehnološki iskorak kod četvrte generacije senzora glutamata leži u tome što iGluSnFR4 nije samo pasivna „žarulja“. Istraživački tim s Allen Institutea i HHMI-ja je genetskim inženjeringom modificirao strukturu ovog proteina tako da on djeluje kao molekularna sklopka.

• Senzorska domena: Protein u sebi sadrži specifičan receptor koji prepoznaje isključivo molekule glutamata.

• Mehanizam aktivacije: Kada se glutamat veže na taj receptor, cijela molekula proteina mijenja svoj geometrijski oblik, odnosno konformaciju.

• Svjetlosni signal: Ta promjena oblika izravno utječe na intenzitet fluorescencije, pretvarajući kemijski događaj u sinaptičkoj pukotini u vizualni bljesak koji znanstvenici mogu snimiti mikroskopom.

Glavna prekretnica kod ove varijante je postizanje osjetljivosti na razini pojedinačne vezikule u uvjetima in vivo. To znači da senzor može detektirati otpuštanje tek nekoliko stotina molekula glutamata iz jednog mjehurastog spremnika (vezikule), što je dosad bilo gotovo nemoguće u živom tkivu zbog ekstremno brzih stopa deaktivacije signala. Upravo ta brzina i osjetljivost omogućuju istraživačima da prate mozak ne kao statičnu mapu, već kao izrazito dinamičan proces u realnom vremenu.

Zahvaljujući precizno prilagođenim kinetikama senzora, znanstvenici sada mogu razlikovati pojedinačne poruke unutar kompleksnih neuronskih razgovora koji su se ranije stapali u nečitljiv šum.

Klinička revolucija i granice tehnologije

Kada se u kontekstu mozga spomene glutamat, kliničari često pomisle na ekscitotoksičnost – stanje u kojem previše glutamata može doslovno „spržiti“ neurone. Taj se mehanizam veže uz epilepsiju, a često se navodi i u ranim fazama neurodegenerativnih bolesti, uključujući Alzheimerovu. Zato zvuči primamljivo pomisliti da bi „gledanje“ glutamata moglo poslužiti kao brza dijagnostika.

Ali iGluSnFR4 nije čarobni štapić za otkrivanje i dijagnostiku neuroloških bolesti kod ljudi. To je vrlo korisna laboratorijska alatka, prvenstveno namijenjena radu na modelnim organizmima – i upravo je u tome njezina najveća vrijednost: omogućuje da se u životinjskim modelima bolesti opaze rane promjene u sinaptičkoj komunikaciji, one koje se događaju prije nego što nastupe vidljivi simptomi ili masivnije odumiranje stanica.

A ako je moguće preciznije mapirati trenutak kada sinapse počnu „brljati“ s glutamatom, otvara se šansa za intervencije koje bi taj proces zaustavile ranije – prije nego što šteta postane nepovratna.

Farmakologija 2.0: lijekovi s vizualnim dokazom

Razvoj lijekova za mozak tradicionalno se provodio metodom pokušaja i pogrešaka, i to s prilično niskim postotkom uspješnosti. Jedan od ključnih razloga relativne neuspješnosti bio je naizgled banalan: teško je upravo tamo gdje je najvažnije – na razini sinapse – izmjeriti radi li potencijalni lijek ono što bi trebao raditi.

Danas senzori poput iGluSnFR4 unaprjeđuju farmakologiju iz „gađanja naslijepo“ u područje izravnog promatranja učinkovitosti uživo: eksperimentalni lijek moguće je primijeniti, pa potom u realnom vremenu gledati kako se mijenja dinamika otpuštanja glutamata.

Umjesto nagađanja iz ponašanja miša u labirintu, može se izravno vidjeti smanjuje li se patološki šum u mreži, vraća li se normalniji ritam komunikacije među neuronima. To uvelike skraćuje put od testiranja u laboratoriju do svrhovitijih kliničkih hipoteza.

Nova optika za staru enigmu

Možda najvažnija praktična vijest je da iGluSnFR4 nije ostao zatvoren iza laboratorijskih vrata samo jednog instituta: istraživači su mu dali status „public domain“ alata i dostupan je svima preko Addgene(neprofitne banke plazmida za istraživače), što ga pretvara u dio globalnog „open source“ arsenala neuroznanosti.

Premda služi za očitavanje složene mrežne aktivnosti neurona, iGluSnFR4 nije uređaj za čitanje misli – i bolje da nije! – već predstavlja znanstveno korisniju alatku: senzor glutamata kao precizna visokobrzinska mikroskopska kamera za sinapse ne bilježi samo strukturu mozga (anatomiju), niti samo njegovu potrošnju energije (fMRI), nego hvata i bilježi samu srž neuronske komunikacije: živi protok informacije kroz sinapse.

Kad nevidljivi kemijski signali postanu mjerljivi pod mikroskopom, teorije o tome kako mozak radi prestaju biti književna fikcija i postaju nešto što se može testirati, popravljati – i, u najboljim slučajevima, koristiti kao podlogu za pametnije i učinkovitije individualizirano liječenje.

^{Igor „Doc“ Bereckije pedijatar-intenzivist na Odjelu intenzivnog liječenja djece Klinike za pedijatriju KBC Osijek. Pobornik teorijske i praktične primjene medicine i znanosti temeljene na dokazima, opušta se upitno ne-stresnim aktivnostima: od pisanja znanstveno-popularnih tekstovau tiskanom i online-izdanju časopisâ BUG, crtkanja računalnih i old-schoolgrafika i dizajna, zbrinjavanja pasa i mačaka, fejsbučkog blogiranja o životnim neistinama i medicinskim istinama, sve do kuhanja upitno probavljivih craft-piva i sasvim probavljivih jela, te neprobavljivog sviranja bluesa.}